Ферменты-рестриктазы и рестрикция ДНК
Страница 2

Генная инженерия » Ферменты-рестриктазы и рестрикция ДНК

Результативность электрофореза очень высока, поскольку с его помощью могут быть разделены фрагменты, размеры которых составляют от 2 до 50 000 оснований.

После электрофореза фрагменты из агарозы выделяют с помощью разных методов. На основании результатов сравнения размеров рестриктов одной и той же ДНК, полученных с помощью разных рестриктаз, строят рестрикционные карты, на которых показывают сайты рестрикции каждой из использованных рестриктаз В практическом плане рестрикционные карты позволяют определять не только размеры рестриктов, но и выяснять расположение в молекулах ДНК локусов тех или иных генов.

Поскольку у высших организмов в ходе транскрипции синтезируется гетерогенная ДНК, корректируемая процессингом, то в генной инженерии обычно используют комплементарную ДНК (кДНК), которую получают при использовании в качестве матрицы мРНК, на которой обратная транскриптаза синтезирует одноцепочечную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК. В последующем эти одноцепочечные ДНК превращают в двухцепочечные ДНК. Считают, что кДНК содержит непрерывные нуклеотидные последовательности (транскрибируемые и транслируемые). Именно кДНК используют для рестрикции.

Выделенные после электрофореза из агарозных гелей фрагменты ДНК (рестрикты) можно предварительно подвергнуть секвени-рованию, т. е. определить в них нуклеотидную последовательность. Для этого используют химический и ферментативный методы сек-венирования.

Химический метод основан на получении меченных радиоактивным фосфором (32р) фрагментов и удалении из этих фрагментов одного из оснований с последующим учетом результатов радиоавтографии гелей, содержащих эти фрагменты. Ферментативный метод основан на том, что в конец анализируемого фрагмента вводят нуклеотид, используемый затем в синтезе разных фрагментов in vitro, анализируемых на нуклеотидную последовательность электрофоретически. Для изучения специфических последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК используют также гибридизацию ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК, Нозерн- и Саузерн-блоттинги.

Страницы: 1 2 


Рекомендуем к прочтению:

Объекты и методы исследований. Объекты исследования
Использовались различные объекты, такие как почва из ясеневого леса и поля, растительные волокна, а также пищевые продукты, а именно консервы: килька в томатном соусе и баклажанная икра. ...

Восстановление во время критического периода
В какой степени возможно восстановление после депривации во время критического периода? Даже если депривированный глаз после критического периода остается открытым на протяжении месяцев и лет, повреждение является перманентным, происходит ...

Собственные исследования
Схема 1 направления исследования Сбор хмеля и подготовка его к исследованию ↓ Сушка хмеля ↓ Приготовление смыва ↓ Первичный посев ↓ Инкубирование ↓ Микроскопирование колоний ↓ Получение ЧКД ...