Определение специфичности полученных антител

Специфичность антител на белок с м.м. 55 кДа определяли методом Вестерн-блот. Для этого выделенный из МХ печени крысы и очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа наносили на ДДС-ПААГ электрофорез с 10%-ым ПААГ гелем с нагрузкой на полосу 10 мкг. На другую полосу наносили 10 мкг тотальной белковой фракции МХ. Порядок нанесения образцов дублировался на том же геле. После электрофоретического разделения белков половина геля, содержащая оба образца и стандарт молекулярных масс, окрашивалась серебрением [Shevchenko et al., 1996]. Вторая половина использовалась для переноса на нитроцеллюлозную мембрану с последующей обработкой полученными антителами (п.п. 5.2.2. «Материалов и методов»). При этом исследуемую антисыворотку разводили 1:300, вторичные антитела – 1:500.

1 2 3

1 2

А

Б

Рисунок 17. А. ДСН-электрофорез фракций

1 – очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 – молекулярные стандарты массы белков, 3 – суммарный белок МХ. Б. Вестерн-блот анализ: 1 – очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 – суммарный белок МХ.

Показано, что полученные в работе антитела специфически связываются только с белком с м.м. 55 кДа, и не вязываются ни с одним из массы белков, находящихся в МХ (Рис.19). Таким образом, в работе были получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м. 55 кДа.

Этим же методом было установлено, что поликлональные антитела на исследуемый белок-канал, полученный из МХ печени крысы, не взаимодействует с той же концентрацией аналогичного белка с м.м. 55 кДа, выделенного тем же методом из МХ сердца крысы. Данный факт указывает на то, что исследуемый белок с м.м. 55 кДа тканеспецифичен.


Рекомендуем к прочтению:

Слава на весь мир
28 декабря 1895 года Рентген закончил большую статью, в которой он подробно описал свои опыты с невидимыми лучами. Эту статью он отправил в журнал Вюрцбургского физико-медицинского общества. Статья сейчас же была сдана в печать. Но уже за ...

Нейроны
Среди большого количества нейронов человеческого мозга обнаружено множество непохожих друг на друга клеток, однако в их строении можно найти общие отличительные признаки (рис. 1). У каждого нейрона есть тело (другие названия этой части не ...

Плазмиды. Понятие и типы плазмид
Наиболее распространённым методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных (содержащих чужеродный ген) плазмид, которые представляют собой кольцевые, двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов и с ...